共焦拉曼成像获得的图像为微米空间分辨率的样品提供了信息。这些图像基于分子结构，对化学和物理性质的微小变化非常敏感。
此外，共焦拉曼成像有助于对半透明、非浑浊样品的地下特征进行无损分析(取决于光学特性，其深度可达几百微米)。这个过程不需要横切或暴露样品的内部部分。通过对样品中不同深度采集的拉曼图像进行整理，可以生成三维化学图像。
通过使用标准(冶金)显微镜物镜从样品中收集图像，可以引入表面分析中没有遇到的导致像差和结果质量降低的复杂因素。当光通过折射率大于空气的材料时，近轴光的聚焦不同于离轴光(球差)。n> 1)。
如图1所示，由于球面像差，焦点变得模糊，这种效果随着深度的增加而升级。由于实际采样深度的失真，三维图像沿z(焦点)轴出现压缩。此外，焦点的扩散也会导致空间分辨率和拉曼强度的损失。
图1所示。(a)以空气作为物镜和焦点之间的中间介质，对样品表面进行聚焦。(b)在高折射率的透明样品内聚焦，球面像差使焦点模糊。
通过使用孔径实现共焦成像，可以弥补部分空间分辨率的损失，因为这将收集的信号限制在焦点周围的区域。然而，这伴随着拉曼强度的降低。减少意味着全部拉曼显微术的三维成像潜力没有传统显微镜目标未解锁。
可以纠正使用数学校正的这种保真度。然而，这些在寻址像差方面的复杂性和完整性都有所不同。还不可能恢复拉曼强度和空间分辨率的损失。可以在其他地方找到关于这些数学和半经验校正的更多关于这些数学和半经验校正的信息，在本文中不会进一步讨论。1，2
另外，浸没物镜可以用于解决像差光学。用指标匹配流体(而不是空气)填充物镜和样品之间的间隙，可以减少或消除球差。简单地说，这恢复了失去的空间分辨率和拉曼强度，并消除了光在样品表面的弯曲。
周围有折射率的油n≈1.5(类似于许多聚合物材料)通常用于油浸物镜。亚博网站下载油的使用也促进了更高的数值孔径(更好的有效聚焦和分辨率)，这增加了收集到的拉曼强度。此外，油浸降低了样品形状的影响，最终获得了较好的三维拉曼成像结果。
本文举例说明了使用Thermo Scientific™DXR3xi拉曼成像显微镜的油浸物镜，以改善埋藏或地下结构的三维拉曼成像。
实验
一个Thermo Scientific™DXR3xi拉曼成像显微镜并且随附的Thermo Scientific™amnic™Xi软件用于创建此处提供的3-D拉曼图像。在OMNICXI软件中包含了用于使用交互式3-D可视化功能的3-D拉曼数据集和用于生成3-D拉曼图像的内置工具的两种工具。
奥林巴斯™MPlanN 100X BD物镜用于收集成像数据，作为代表性的冶金物镜，奥林巴斯™PlanApo 100X用于油浸物镜成像数据。所使用的浸渍油是无荧光的，折射率为1.516。对于所有的拉曼图像，在样品处使用功率为10 mW的532 nm激光。
结果与讨论
多层聚合物复合材料的研究是拉曼共焦深度分析的常用应用。
在本例中，所选的层状聚合物复合材料厚度约为124 μm，由5个不同的层组成。采用冶金物镜和浸没物镜，分析了体积为30 μm × 30 μm × 135 μm的图像，x、y和z方向的像素尺寸分别为1 μm和1 μm。在三个关键方面，浸没物镜的性能得到了增强:精确的层厚测量、提高信噪比和提高光谱纯度。
利用冶金物镜(a)和油浸物镜(b)获得的基于MCR(乘法曲线分辨率)的三维拉曼图像如图2所示。通过OMNICxi，可以使用MCR分析自动分割层，而无需在分析前直接了解成分的拉曼光谱特征。
图2。(a)利用冶金物镜对分层聚合物复合膜进行MCR分析的三维拉曼图像。(b)利用油浸物镜对同一层状聚合物复合膜进行MCR分析的三维拉曼图像。用油物镜分析，比用冶金物镜分析，层数更清楚、更清晰。
为便于对比，同一聚合物复合材料物理截面的二维成像结果如图3所示。当使用冶金物镜时，与使用油浸物镜的三维图像和从截面上获取的二维图像相比，层有显著的压缩。
图3。层状聚合物复合材料截面的二维拉曼图像和视觉图像。该参考测量显示的层厚度与使用油浸物镜的三维拉曼图像非常吻合。
用浸油物镜采集的三维图像确定的层厚与截面的二维图像有很好的一致性。在使用冶金物镜的共焦三维图像中的层显然也没有很好地定义，并经历了焦点模糊和空间分辨率的损失。
清晰度的缺乏导致界面上光谱特征的混合增加。在厚度测定方面的一些额外的不确定性也是这个结果。通过使用浸没物镜可以获得测量层厚的优良结果。
拉曼强度的大幅增加是使用油浸物镜的另一个优点。图4显示了两组三维共焦成像数据对聚乙烯醇层中间位置的拉曼光谱的比较。绿色光谱代表油浸物镜，提供约3倍的拉曼强度和信噪比(S/N)的光谱。
图4。层状聚合物复合膜中聚乙烯醇层的光谱表明，拉曼强度和信噪比(S/N)至少增加了3倍。根据1441 cm处的峰值强度计算信噪比－1在2300 ~ 2200 cm范围内计算噪声均方根－1．
最后，利用浸渍物镜获得的三维化学图像显示了不同聚合物层之间较好的光谱分离。聚乙烯醇层夹在两层聚酰胺之间，在1635厘米处有很强的拉曼光谱－1．通过比较这个光谱特征的相对强度和聚乙烯醇波段(1441厘米)的相对强度，可以测量光谱分离－1）.在图5中，蓝色的痕迹代表了从横截面图像中获得的合理纯聚乙烯醇光谱。
图5。层状聚合物复合膜中聚乙烯醇层的光谱来自于使用冶金物镜(红色)和油浸物镜(绿色)的3-D共焦数据集，以及物理横截面的2-D图像(蓝色)。峰值高度比(1635厘米－1/ 1441 cm-1)给出邻近聚酰胺层的光谱贡献的测量，并说明使用油浸物镜进行三维共焦拉曼成像时邻近层的光谱贡献减少了。
这基本上显示在1635厘米没有拉曼特征－1．图5中的红色迹线代表了使用冶金物镜从3-D体积中提取的聚乙烯醇的光谱。这突出了聚酰胺的小但不同的贡献，这将是由层之间的光谱混合来产生的。
然而，在用绿色痕迹表示的油浸物镜中，邻近聚酰胺层的相对贡献显著减少。这表明，在这种类型的三维共焦拉曼深度成像中，油浸物镜获得了较好的效果。
反过来，这导致更精确的层厚度测量，从各层改善光谱纯度，以及用于测量的总增加的信号对噪声。由于结果与横截面的分析相当，因此不需要额外的复杂性。
折射率差异的影响会因非平面形状和表面而加剧。然而，在这种情况下，沉浸目标也可以应用。直径约为25微米的聚苯乙烯球(Polysciences, Inc.)的拉曼成像就是说明这一点的一个例子。亚博老虎机网登录用标准金相物镜和油浸物镜在玻璃显微镜载玻片上成像聚苯乙烯球。
图6显示了结果。如图c和d所示，除了显著的拉曼强度损失外，在球的下半部分，随着冶金物镜沿z轴出现延伸和变形。这是由于折射。在较小的程度上，这也是由于球体曲面的反射效应和与周围空气相比的折射率差异造成的。
图6。(a)和(b)使用油浸物镜采集的25 μm聚苯乙烯球的拉曼图像，(c)和(d)使用冶金物镜采集的同一25 μm聚苯乙烯球的拉曼图像。浸油图像显示出精确再现的球体，而冶金物镜图像显示出明显的畸变。
如在图像A和B中所见，没有细长尾部以及具有更明确的边缘的透明球形示出，其具有与浸没物镜成像的相同的球体。这说明由于样品的形状，可以引入额外的复杂因子，在执行3-D拉曼成像时结合折射率的差异。然而，再次使用浸没物镜可以帮助减少这些效果。
这些原则也适用于具有不同层和非平面特征的样品，如双组分光纤。在双组分纤维中，有两个组分没有混合在一起，而是在纤维中有离散的排列(例如，并排、分节、芯鞘)。这些都是为了充分利用成分的不同性质而设计的。
在这里成像的双组分光纤中有一个芯鞘结构。该纤维的直径约为20微米，具有尼龙6的外护套和尼龙6,6的内芯。基于MCR分析的光纤三维共焦成像结果如图7所示。图像d, e和f是用冶金物镜拍摄的，图像a, b和c是用浸油物镜拍摄的。正如在聚苯乙烯球的例子中，当使用冶金物镜时，拉曼强度向纤维的底部显著下降，以至于纤维的底部根本没有定义。
图7。（a），（b），（c）使用油浸没物镜收集的双组分纤维（尼龙6,6（绿色）和尼龙6（紫色），芯鞘装置的共焦3-d拉曼MCR图像．（D），（E），（F）共聚焦3-D使用冶金物镜收集的相同双组分纤维的3-D拉曼图像。视图（c）和（f）显示沿着3-d拉曼MCR图像的z轴分别查找的切片，分别用于油和冶金目标。
在地核和鞘层的边界位置上也存在明显的不确定性。通过使用油浸物镜采集的相同纤维的三维图像显示出清晰、合理对称的截面。
当试图以类似于层状聚合物复合材料的方式从物理上横截面这种20微米的纤维时，证明是有问题的。光纤的物理变形是直接安装和横切光纤的方法的结果。更严格的安装技术，例如树脂包埋，将大大增加复杂性和时间所花。利用油浸物镜进行三维共聚焦拉曼成像，提供了一种不需要复杂样品制备的无损溶液。
结论
利用共焦三维拉曼成像技术，可以在不暴露样品内部的情况下对半透明样品进行地下成像。冶金物镜可能擅长于表面分析，但当用于探测样品内部时，它们受到球差的影响。数学修正可以部分解释球差的影响，但不能完全补偿空间分辨率和拉曼强度的损失。
使用储油目标是光学解决这个问题的有效方法。它还可以增加多种材料的地下成像的性能，包括大多数聚合物。亚博网站下载和DXR3拉曼显微镜，浸出物品是标准配件，其简单的实施有可能解锁任何实验室中的3-D拉曼成像的力量。
参考资料和进一步阅读
- J.拉曼光谱。2014年, 45岁,133 - 138
- M.P. Miguel, J.P. Tomba, J. Raman Spectrosc。2013年, 44岁,447 - 452
这些信息来源于赛默费雪科学材料与结构分析公司提供的材料。亚博网站下载
有关此来源的更多信息，请访问赛莫费雪科学材料与结构分析。亚博网站下载