提高序列块面扫描电子显微镜的图像质量

自动化技术SBFSEM用于在由Denk和Horstman设计的用于三维重建的SEM中获得序列图像^1.并由Gatan作为3View进行商业化^®系统由此产生的大体积数据集可以在高轴向和横向分辨率下进行定量评估，就像Leapman等人对小鼠胰岛线粒体网络的检查一样。^2.此外，sbsem在材料科学应用中具有巨大的潜力，可以通过大体积生成纳米分辨率的块状材料和亚博网站下载界面的三维图像亚博老虎机网登录^3.．

数据集可能包含数百或数千张图像，因此，污染和充电导致的图像质量损失可能会破坏实验。由于碳氢化合物污染导致对比度恶化，必须经常清洁和更换BSE背散射电子探测器。

许多电子显微镜学家采用远程等离子清洗技术Evactron^®等离子体清洁通过减少或去除污染，从仪器中获取尽可能好的图像。等离子体中产生的氧自由基氧化碳氢化合物，产生CO等物种_2.， CO和H_2.O被真空系统除去。在XEI Scientific进行的几项研究表明，vactron可以有效地去除碳氢化合物，这是通过使用之前被污染的石英晶体微天平来确定清洁率的量化结果得出的。^4.本研究阐述了等离子体清洗对优化生成3View数据集和清洗背散射探测器的好处。

理论与背景

SBFSEM系统包括扫描电镜、安装在显微镜室门内壁上的金刚石刀切片机，以及控制采集过程的软件和硬件(Denk和Horstmann, 2004)。为了在没有用户干预的情况下产生连续图像，一个树脂包埋的标本被切割和成像数千次。图1a显示了赫尔辛基大学生物技术研究所FEI Quanta 250上专用3View stage的标准实验室配置示例。图1b显示了3View切片机的近距离视图，包括位于左边清晰位置的刀和位于右边发光的样品架。根据端口的可用性，紧凑的vacutron EP等离子吸尘器(图1c)可以安装在SEM腔体的各个位置，考虑端口距离真空出口最远的位置为最佳位置。如图1d所示的是一个受烃类污染的后向散射检测器的例子，它表现出信号到噪声的降低和差的对比度。

图1所示。硬件用于sbsem实验:a)典型的sbsem系统，b) Gatan 3View切片机的细节，c)安装在Zeiss Sigma SEM腔上的真空EP等离子体清洁器，d)受污染的背散射检测器。

亚博网站下载材料和方法

采用Sigma VP SEM (Carl Zeiss Inc.)，配备3View SBFSEM系统(Gatan Inc.)和XEI Scientific evtron EP去污器(图1c)进行实验。首先，在1- 3kv、2000倍放大率下对树脂包埋的小鼠心肌标本进行成像。然后样品在30 kV辐照10分钟，随后成像以检查胶体银区域的对比度损失和在机加工铝sbsem存根上形成的污染扫描矩形。使用Gatan GMS 3.2软件，生成清洗前后Caco-2细胞上的胶体银漆区域和幽门螺杆菌切片的图像对比直方图。为了消除样品、背向散射检测器和腔室中的碳氢化合物污染，使用了在20 W下5分钟、在X5下2分钟的清洁配方。

后果

图2描绘了铝sbsem存根上的污染伪影(a, b)，在一次等离子清洗(c, d)后未检测到。在图3中，对相邻的胶体银dag区域进行比较，发现在一次等离子清洗周期后BSE对比增加了14%。测量重复三次，以确认结果的一致性。为了确保背向散射电子对探测器上的污染层更加敏感，使用了1.2 kV的低加速电压。当加速电压较低时，样品表面的充电和束损伤较小。

图2。等离子清洗（c，d）后，铝短棒（a，b）表面无污染伪影。

图3。等离子体清洗SBFSEM样本周围的胶体银dag区域后，对比度增加14%。

图4。血浆清洗前后对小鼠心脏组织块面进行20倍扫描和成像。

这些结果与Joubert发表的数据令人满意地吻合^5.如图5所示。在这种情况下，对树脂包埋细胞的两幅图像的对比水平的分析显示，在3次清洗周期(每次6分钟)后，对比水平增加了15%。此类清洁协议通过提高图像对比度和信噪比，去除图像伪影和电荷，有助于获得准确的三维建模和sbsem数据集的比较形态分析。

图5。《Joubert》中的图像分析^5.在血浆清洗后，cACO-2细胞上的幽门螺杆菌薄片对比显示增加了15%。

泵停机时间的延长不仅延长了背散射探测器的寿命，还显示了FIBs和sem中碳氢化合物污染水平的依赖性。因此，这个时间可以作为真空系统清洁度的指标。以下数据表明，真空等离子体清洁器大大减少了sem和fib的泵停时间以及碳氢化合物污染，从而帮助增加了样品处理吞吐量，而不影响分析质量。

在下游或远程等离子体清洗中，氧自由基形成，以激发等离子体的形式充满真空室。真空等离子体清洗采用空气作为工艺气体。在低压下，受激发的亚稳态氮分子表现出流动的紫外光余辉，其特征是粉红色/紫色。等离子体紫外余辉中中性自由基的浓度是等离子体中生成速率和中性余辉中损失率的函数。

结论

将等离子体清洗作为sbsem实验期间的常规操作，可以减少污染伪影和充电，提高图像质量，加速泵送，并在扩展数据采集期间保持原始真空系统。随着扫描电子显微镜需要延长操作时间的增加，保持真空室清洁条件的必要性也随之增加。重要的是，sbsem系统要24/7运行，最好保持在不受污染的条件下，图像质量不受影响。

当大的块状树脂嵌入样品经常成像时，碳氢化合物被释放到真空室中，导致检测器效率降低。例如，为了确保快速成像的最佳条件，蔡司MultiSEM 505配备了两个等离子清洁器，用于清除负载锁和主腔室中的外来碳氢化合物。

当代蒸发涡轮等离子体™ 去污剂采用温和的、下游等离子体余辉过程，消除来自fib、sem和其他分析工具的碳氢化合物(HC)污染。在涡轮泵压力下，真空清洗变得更快，并扩散到整个腔室。这归因于较长的平均自由路径，导致较少的氧自由基重组所需的三体碰撞和减少散射到室壁。在大多数情况下，短等离子清洗周期足以消除污染，并大大减少泵停机时间，使样品处理和分析的高吞吐量。

真空系列等离子清洗机提供了快速，强大，有效的清洗范围广泛的压力，允许无伪，高质量的图像和提高样品分析效率。如果将等离子清洗包括在常规维护协议中，就有可能保持最佳的检测器性能。

参考资料及进一步阅读

1. Denk，W.和H.Horstmann（2004）PLoS Biol。2, 1900.
2. Leapman, R. et al.，(2016)显微和显微分析22 (supl . 3)， 1104。
3. 桥本，T.等人，（2016）超微显微镜163,6。
4. Vane，R和E.Kosmowska（2016）显微镜和显微分析22（补充3），46。
5. Joubert，L.M.（2013）显微镜与分析，第15期。

这些信息已经从XEI Scientific提供的材料中获得、审查和改编。亚博网站下载

有关此来源的更多信息，请访问XEI科学。